Полимеразын гинжин урвал

Чөлөөт нэвтэрхий толь, Википедиагаас
Харайх: Удирдах, Хайлт
«ПГУ» үгээр энд холбогдлоо. Өөр зүйлийн хуудсыг «ПГУ (салаа утга)»-аас олж болно.
Найман ширхэг ПГУ-ын бортого бүхий хүхээ. Бортого бүр нь 100 µл урвалжын багтаамжтай.

Полимеразын гинжин урвал (ПГУ) нь молекул биологид өргөн хэрэглэгддэг шинжилгээний арга юм. Үүний нэр нь ДНХ полимераза гэдгээс гаралтай. ДНХ полимеразагаар ДНХ-ын өчүүхэн хэсгийг зохиомол орчинд буюу (инвитрод) ферментийн репликац ашиглан олшруулдаг (ампликац). Полимеразын гинжин урвал явагдахад өөрөө өөрийгөө үүсгэсэн ДНХ нь олшруулалтад хэрэглэгдэх загвар болдог. Улмаар ДНХ-ын загвар экспоненциалаар олшрох гинжин урвал хөдөлгөөнд орж эхэлдэг. ПГУ-ын тусламжтай ДНХ-ийн өчүүхэн хэсгийн ганц эсвэл цөөн хуулбарыг олшруулж хэдэн сая болон түүнээс дээш ДНХ-ийн хэсгийг гарган авах боломжтой. ПГУ-ыг ДНХ-ын хэлбэрийг өөрчлөхгүйгээр гүйцэтгэх мөн боломжтой бөгөөд үүнийг өргөжүүлэн хөгжүүлж генетикийн инженерчлэлийн өргөн талбарт хэрэглэж болдог.

Бараг бүх ПГУ-ын арга нь дулаанд тогтвортой ДНХ полимеразаыг ашигладаг. Тухайлбал Термус акуатикус бактериас гаргаж авсан фермент болох Таку полимеразааг ашигладаг. Энэхүү ДНХ полимераза нь дан хэлхээт ДНХ-г загвар болгон ашиглаж ДНХ-г бүрэлдүүлэгч нэгж болох нуклеотидуудаас шинэ ДНХ-ийн хэлхээг ферментийн тусламжтай нийлэгжүүлэх замаар бүрэлдүүлдэг бөгөөд үүнд ДНХ-ийн олигонуклеотидуудыг (мөн ДНХ праймеруудыг ч гэж нэрлэдэг) ДНХ-ийн нийлэгжилтийг эхлүүлэхэд хэрэглэдэг. ПГУ-ын аргуудын ихэнх нь термал циклерийг ашигладаг бөгөөд энэ төхөөрөмж нь ПГУ-ын дээжийг тодорхой температурын шатлалуудын дагуу явуулах үүднээс ээлжлэн халааж, хөргөх процессыг явуулдаг. Эдгээр өөр өөр температурын шатлалууд нь ДНХ-ийн хос мушгиа хэлхээг задлахад (ДНХ хайлалт) шаардлагатай бөгөөд ДНХ полимеразааг ашиглан ДНХ-ийн нийлэгжилтийг эхлүүлж бай ДНХ-г сонгон олшруулах боломж олгодог. ПГУ-ын хүчин чадал болон сонголт нь гол төлөв праймеруудыг хэрхэн сонгохоос хамаардаг ба праймерууд нь олшруулахаар сонгосон ДНХ-ийн муж болон ашиглах термо циклийн горимоосоо ихээр хамаардаг.

ПГУ-ын зарчим болон ажиллах горим[засварлах]

Зураг 1a: Дээр үеийн ПГУ-ын термоциклер
Зураг 1b: Нилээн дээр үеийн ПГУ-ын гурван температруын шатлал бүхий термоциклер

Полимеразын гинжин урвалыг ДНХ-ийн хэлхээний тодорхой хэсгийг (бай ДНХ) олшруулахад ашигладаг. Тэр тодорхой хэсэг нь дан ганц ген, генийн хэсэг, эсвэл кодлогдоогүй дараалал байж болно. Ихэнх ПГУ-ын аргуудын нийтлэг тал нь дээд тал нь 10 кило хос суурь (кс) хүртэл урттай хэрчимүүдийг олшруулдаг. Гэвч зарим аргууд нь 40 кс хэмжээтэй хэрчимүүдийг олшруулах боломжтой байдаг.[1]

Үндсэн ПГУ-ыг тавихад хэд хэдэн найрлага болон урвалж шаардлагатай болдог.[2] Эдгээр найрлагуудыг дурдвал:

  • Олшруулахаар төлөвлөсөн ДНХ-ийн хэсгийг агуулсан ДНХ-ийн загвар.
  • ДНХ-ийн мужийн 5' (таван праймын) болон 3' (гурван праймын) төгсгөлүүд дээрх ДНХ-ын хэсгийг нөхдөг нэг болон эсвэл хэд хэдэн праймерууд.
  • ДНХ полимераза тухайлбал Таку полимераза эсвэл 70 °C орчимд тохиромжтой өөр ДНХ полимераза.
  • Дезоксирибонуклеотид трифосфат (дНТФ) нь тулгуур өрөгч буюу эдгээрээс ДНХ полимеразаар шинэ ДНХ хэлхээг нийлэгжүүлдэг.

Ажиллах зарчим[засварлах]

Зураг 2: ПГУ-ын мөчлөгийн схем зураг. (1) Denaturing at 94-96°C. (2) Annealing at ~65°C (3) Elongation at 72°C. Four cycles are shown here.

ПГУ нь гол төлөв 20-оос 35 хүртэл давтагдах температурын өөрчлөлтүүдийн цувралаас бүрдэнэ. Эдгээр өөрчлөлтүүдийг мөчлөг буюу цикл гэдэг. Мөчлөг бүр нь 2-3 удаагийн тасралттай (дискрет) температуруудын шатлалаас бүрддэг. Хамгийн түгээмэл ПГУ нь температурын гурван шатлалтай мөчлөгүүдээр явагддаг (Зураг 2). Мөчлөг бүр нь ихэвчлэн өндөрт хэмд (>90 °C) температурын нэг шатлалаар эхлэх бөгөөд үүнийг барилт гэдэг. Улмаар эцсийн бүтээгдэхүүний өргөтгөл эсвэл түр хадгалалтын төгсгөлд дахин нэг барилт явагддаг. Мөчлөг бүрд ашиглагдах температурын хэмжээ болон тухайн температурт барих хугацаа зэрэг нь олон хүчин зүйлсээс хамаардаг. Эдгээрт ДНХ-ийн нийлэгжилтэд хэрэглэгдэх фермент, урвал дахь дНТФ (дезоксирибонуклеотид трифосфат) болон хоёр валентын ионуудын найрлага, мөн праймеруудын хайлах температур (Tm) зэрэг нь ордог.[3]

  • Эхлэх шатлал: Энэ шатлалд урвалыг 94-96 °C (хэрэв дулаанд маш тогтвортой полимераз хэрэглэгдэж буй үед 98 °C хүртэл) температурт хүртэл халаана. Энэ температурт 1-9 минут орчим барьдаг. Энэ нь зөвхөн халуун эхлүүлэлттэй ПГУ-аар (ХЭ ПГУ) тавигддаг дулааны идэвхжүүлэлт шаарддаг ДНХ полимеразуудад ашиглагддаг.[4]

Ишлэл[засварлах]

  1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R (1994). "Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA". Proc Natl Acad Sci. 91: 5695-5699. PMID 8202550.
  2. Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-576-5.  Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction
  3. Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE (1990). "Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro". Nucl Acids Res 18: 6409-6412.
  4. D.J. Sharkey, E.R. Scalice, K.G. Christy Jr., S.M. Atwood, and J.L. Daiss (1994). "Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerase Chain Reaction". Bio/Technology 12: 506-509.